1、 電泳法(三個(gè)主要的方法，步驟)

　　電泳法

　　電泳法是指帶電荷的供試品(蛋白質(zhì)、核苷酸等)在惰性支持介質(zhì)(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)中，于電場(chǎng)的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其含量(%)的方法。

　　各電泳法，除另有規(guī)定外，照下述方法操作.

　　第一法 紙電泳法

　　1.儀器裝置 包括電泳室及直流電源兩部分。

　　常用的水平式電泳室裝置如圖，包括兩個(gè)電泳槽A和一個(gè)可以密封的玻璃(或相應(yīng)材料)蓋B;兩側(cè)的電泳槽均用有機(jī)玻璃(或相應(yīng)材料)板C分成兩部分;外格裝有鉑電極(直徑0.5～0.8cm)D;里格為可放濾紙E的有機(jī)玻璃電泳槽架F，此架可從槽中取出;兩側(cè)電泳槽A內(nèi)的鉑電極D經(jīng)隔離導(dǎo)線(xiàn)穿過(guò)槽壁與外接電泳儀電源相連。電源為具有穩(wěn)壓器的直流電源，常壓電泳一般在100～500V，高壓電泳一般在500～10 000V。

　　2. 操作法

　　(1) 電泳緩沖液 枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)。取枸櫞酸 (C6H8O7•H2O)

　　39.04g與枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7•2H2O)4.12g，加水4000ml，使溶解。

　　(2) 濾紙 取色譜濾紙置1mol/L甲酸溶液中浸泡過(guò)夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干，備用�？砂葱枰�裁成長(zhǎng)27cm、寬18cm的濾紙，或根據(jù)電泳室的大小裁剪，并在距長(zhǎng)度方向一端5～8cm處劃一起始線(xiàn)，每隔2.5～3cm處做一記號(hào)備點(diǎn)樣用。

　　(3) 點(diǎn)樣 有濕點(diǎn)法和干點(diǎn)法。濕點(diǎn)法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)中，濕潤(rùn)后，取出，用濾紙吸干多余的緩沖液，置電泳槽架上，使起始線(xiàn)靠近陰極端，將濾紙兩端浸入緩沖液中，然后用微量注射器精密點(diǎn)加供試品溶液，每點(diǎn)10μl,共3點(diǎn)，并留2個(gè)空白位置。干點(diǎn)法是將供試品溶液點(diǎn)于濾紙上，吹干、再點(diǎn)，反復(fù)數(shù)次，直至點(diǎn)完規(guī)定量的供試品溶液，然后用噴霧器將濾紙噴濕，點(diǎn)樣處最后噴濕，本法適用于稀的供試品溶液。

　　(4) 電泳 于電泳槽中加入適量電泳緩沖液,浸沒(méi)鉑電極，接通電泳儀穩(wěn)壓電源檔,

　　調(diào)整電壓梯度為18～20V/cm，電泳約1小時(shí)45分鐘，取出,立即吹干,置紫外光燈(254nm)下檢視，用鉛筆劃出紫色斑點(diǎn)的位置。

　　(5) 含量測(cè)定 剪下供試品斑點(diǎn)和與斑點(diǎn)位置面積相近的空白濾紙，剪成細(xì)條,分別置試管中，各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml，搖勻，放置1小時(shí)，用3號(hào)垂熔玻璃漏斗濾過(guò)，也可用自然沉降或離心法傾取上清液，按各藥品項(xiàng)下的規(guī)定測(cè)定吸收度，并按吸收系數(shù)計(jì)算含量.

　　第二法 醋酸纖維素薄膜電泳法

　　1.儀器裝置 電泳室及直流電源同紙電泳。

　　2.試劑 (1) 巴比妥緩沖液(pH8.6) 取巴比妥2.76g、巴比妥鈉15.45g，加水溶解

　　使成1000ml。

　　(2) 氨基黑染色液 取0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。

　　(3) 漂洗液 取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混勻。

　　(4) 透明液 取冰醋酸25ml，加無(wú)水乙醇75ml，混勻。

　　3.操作法 (1) 醋酸纖維素薄膜 取醋酸纖維素薄膜，裁成2cm×8cm的膜條，將無(wú)光澤面向下，浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中,待完全浸透，取出夾于濾紙中，輕輕吸去多余的緩沖液后,將膜條無(wú)光澤面向上,置電泳槽架上,經(jīng)濾紙橋浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中。

　　(2) 點(diǎn)樣與電泳 于膜條上距負(fù)極端2cm處，條狀滴加蛋白含量約5%的供試品溶液2～3μl,在10～12V/cm電位梯度下電泳。電泳區(qū)帶距離以4～5cm為宜。

　　(3) 染色 電泳完畢，將膜條取下浸于氨基黑染色液中，2～3分鐘后，用漂洗液浸洗數(shù)次，直至脫去底色為止。

　　(4) 透明 將洗凈并完全干后的膜條浸于透明液中10～15分鐘，取出平鋪于潔凈的玻板上，干后即成透明薄膜，可于分光光度計(jì)上測(cè)定和作標(biāo)本長(zhǎng)期保存。

　　(5) 含量測(cè)定 未經(jīng)透明處理的醋酸纖維素薄膜電泳圖可按各藥品項(xiàng)下規(guī)定的方法測(cè)定，一般采用洗脫法或掃描法，測(cè)定各蛋白質(zhì)組分的相對(duì)含量(1%)。

　　洗脫法 將洗凈的膜條用濾紙吸干，剪下供試品溶液各電泳圖譜的電泳區(qū)帶，分別浸于1.6%的氫氧化鈉溶液中，振搖數(shù)次，至洗脫完全， 于一定波長(zhǎng)下測(cè)定吸收度。同時(shí)剪取與供試品膜條相應(yīng)的無(wú)蛋白部位，同法操作作對(duì)照。先計(jì)算吸收值總和，再計(jì)算各蛋白組分所占比率(1%).

　　第三法 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法

　　SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白的原理是根據(jù)大多數(shù)蛋白都能與陽(yáng)離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)按重量比結(jié)合成復(fù)合物,使蛋白分子所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)天然蛋白分子的凈電荷，消除了不同蛋白分子的電荷效應(yīng),使蛋白按分子大小分離。

　　1.儀器裝置 恒壓或恒流電源、垂直板或圓盤(pán)電泳槽和制膠模具。

　　2.試劑

　　(1)30%丙烯酰胺溶液 取丙烯酰胺60g與亞甲基雙丙烯酰胺1.6g，加水至

　　200ml，濾紙濾過(guò)，避光保存。

　　(2)分離膠緩沖液 取三羥甲基氨基甲烷36.3g、加水70ml，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.8，加水至100ml。

　　(3)濃縮膠緩沖液 取三羥甲基氨基甲烷6.0g、加水70ml，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8，加水至100ml。

　　(4)電泳緩沖液 取三羥甲基氨基甲烷6.0g、甘氨酸28.8g、十二烷基硫酸鈉1.0g，加水至1000ml。

　　3.操作法

　　(1)制膠 用30%丙烯酰胺溶液-分離膠緩沖液-20%十二烷基硫酸鈉溶液-10%過(guò)硫酸銨溶液(新鮮配制)-四甲基乙二胺-水(5.0∶1.5∶0.08∶0.1∶0.01∶5.3)制成分離膠液，灌入模具內(nèi)至一定高度(剩余體積留作制備濃縮膠用)，用水封頂，聚合完畢，傾去水層。再用30%丙烯酰胺溶液-濃縮膠緩沖液-20%十二烷基硫酸鈉溶液-10%過(guò)硫酸銨溶液-四甲基乙二胺-水(0.8∶1.3∶0.025∶0.05∶0.005∶2.4)制成濃縮膠液，灌在分離膠上，插入樣品梳(如為圓盤(pán)電泳，用水封頂)，待濃縮膠液聚合后，小心除去樣品梳或水。

　　(2)對(duì)照品和供試品溶液的制備 照各藥品項(xiàng)下的規(guī)定。

　　(3)電泳 垂直板電泳：恒壓電泳，初始電壓為80V，進(jìn)入分離膠時(shí)調(diào)至150～200V，當(dāng)溴酚藍(lán)遷移膠底處，停止電泳。圓盤(pán)電泳：調(diào)節(jié)電流使每管8mA。

　　4.固定與染色

　　(1)考馬斯亮藍(lán)染色

　�、僭噭� a.固定液 稱(chēng)取三氯醋酸5g，加水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加水

　　至500ml。b.染色液 稱(chēng)取考馬斯亮藍(lán)R<[250]>0.5g，加水200ml溶解后，加甲醇200ml與冰醋酸50ml，再加水至500ml。c.脫色液 取甲醇400ml、冰醋酸100ml，加水至1000ml，充分混合。d.保存液 取冰醋酸75ml，加水至1000ml，搖勻。

　　②固定與染色 電泳完畢，取出膠片(條)，置固定液中30分鐘，取出膠片(條)，置染色液中1～2小時(shí)，用脫色液脫色至凝膠背景透明后保存在保存液中。

　　(2)銀染色

　�、僭噭� a.硝酸銀溶液 取硝酸銀0.8g，加水至4.0ml，將此溶液滴加到0.1mol/

　　L氫氧化鈉溶液20ml與25%氨溶液1.5ml的混合液中，搖勻，用水稀釋至100ml。

　　b.固定液 取甲醇50ml、37%甲醛溶液54μl，加水至100ml。

　　c.顯色液 取1%枸櫞酸溶液2.5ml、37%甲醛溶液270μl，加水至500ml。

　　d.終止液 取冰醋酸100ml，加水至1000ml。

　�、诠潭ㄅc染色 膠片浸在固定液中至少2小時(shí)后棄去固定液，用水浸洗至少1小時(shí);膠片置1%戊二醛溶液中15分鐘后，用水洗2次，每次15分鐘;膠片置硝酸銀溶液中15分鐘后，用水洗3次，每次15分鐘;膠片置顯色液中，待各帶顯出后置終止液中。

　　5.計(jì)算

　　用卡尺或用掃描定位法測(cè)量溴酚藍(lán)指示劑和蛋白遷移距離(如為圓盤(pán)電泳還應(yīng)測(cè)量染色前后膠條長(zhǎng)度，垂直板電泳膠片厚度低于1mm，染色前后膠片長(zhǎng)度基本不變)。按下式計(jì)算相對(duì)遷移率：

　　蛋白遷移距離 脫色前膠條長(zhǎng)度

　　相對(duì)遷移率(R’<[m]>)=

　　脫色后膠條長(zhǎng)度 溴酚藍(lán)指示劑遷移距離

　　(1)分子量 以R’<[m]>為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回

　　歸，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得供試品的分子量。

　　(2)純度 取膠片(條)，置薄層掃描儀，以峰面積按歸一化法計(jì)算。

　　(3)結(jié)果判斷 供試品主成分遷移率應(yīng)與對(duì)照品遷移率一致.

　　2、 制備凝膠板的方法

　　等電聚焦電泳與瓊脂糖電泳過(guò)程中凝膠板的制備方法和簡(jiǎn)單操作

　　等電聚焦電泳

　　1.制備凝膠板

　　1)30%凝膠母液的制備

　　丙烯酰胺30克，N、N雙甲叉丙烯酰胺0.8克，加蒸餾水至100毫升，溶解后過(guò)濾,貯存于有色瓶?jī)?nèi).

　　2)準(zhǔn)備制膠模具

　　準(zhǔn)備玻璃板涼快，相應(yīng)壓條三根.同樣大小的玻璃紙及聚碳酸脂薄膜各一張(也可不用).文具夾若干.上述用品洗凈晾干后備用.

　　先將玻璃紙用蒸餾水浸透，平放在一塊玻璃上，放三根壓條于其上(這樣就形成一個(gè)膠室)，再放聚碳酸脂薄膜，最后放一張玻璃板，放壓條的地方用文具夾夾緊，兩塊大約錯(cuò)開(kāi)一公分，以備由此處灌膠.

　　3)聚丙烯酰胺凝膠板的制備

　　取30%凝膠母液3.2毫升，依次加50%分析純甘油3.6毫升,雙蒸餾水10毫升，40%載體兩性電解質(zhì)0.72毫升，10%過(guò)硫酸胺0.1毫升，(最好用時(shí)配制，或在制備一周內(nèi)使用)，充分混合后，從框墊開(kāi)口處注入玻璃板夾層內(nèi)的玻璃紙和聚碳酸脂薄膜之間的空間內(nèi)，室溫放置1小時(shí)左右，去掉文具夾及聚碳酸脂薄膜及其上的玻璃板，既為聚丙烯酰胺凝膠板.

　　4)打開(kāi)低溫循環(huán)器開(kāi)關(guān)使水溫降至4℃左右.

　　2.加樣

　　用1*0.5(或0.6*0.5)厘米濾紙片在0.1-0.5%濃度的樣品液中浸潤(rùn)，貼于凝膠板1.5-2厘米處，與凝剿班的方向平行，每個(gè)樣品濾紙片間隔0.5厘米.

　　3.電泳

　　1)放置電級(jí)紙條，以3-4層寬0.6-1.0厘米、長(zhǎng)10厘米的干濾紙條以1mol/L氫氧化鈉置于凝膠板陰級(jí)側(cè)的邊緣，同樣的濾紙條浸以1mol/L磷酸置于陽(yáng)極側(cè)的邊緣.

　　2)將鉑金絲電極板放于凝膠板上，使連接電源陽(yáng)極和陰極的電極絲分別壓在陽(yáng)極側(cè)和陰極側(cè)的電極濾紙條上，最后蓋好電泳槽蓋.

　　3)接通電源開(kāi)關(guān)，按下"預(yù)置"開(kāi)關(guān)鍵，預(yù)置電壓、電流及功率的參考值分別為2500V、50mA、功率80W.然后按下開(kāi)關(guān)鍵，電源即有輸出，電泳開(kāi)始.一般選擇穩(wěn)壓或穩(wěn)功率，電泳時(shí)間1-1.5小時(shí).

　　4.固定

　　電泳結(jié)束后，凝膠板以12.5%三氯醋酸固定20分鐘.

　　5.染色

　　取0.4克考馬斯亮藍(lán)R250加入120毫升甲醇液中20克三氯醋酸，12克磺基水楊酸，蒸餾水400毫升，制成考馬斯亮藍(lán)染色液，將經(jīng)固定的凝膠板放置于染色液中，60℃水浴中染色30分鐘.

　　6.脫色

　　乙醇、冰醋酸及蒸餾水按1:3:6的比列緩和即為脫色液.將染色后的凝膠板放置于該脫色液中，室溫下脫色24-43小時(shí).

　　7.繪PH曲線(xiàn)(此步驟需在電泳結(jié)束后，固定之前進(jìn)行)，測(cè)等電點(diǎn).

　　8.照相

　　凝膠板干燥處理后保存或照相后保留底片.

　　瓊脂糖電泳

　　1.先用膠條封住凝膠托盤(pán)兩端，然后放在水平臺(tái)上.把試樣格固定在試樣格架上，放在凝膠托盤(pán)合適的位置上.把配置好的瓊脂糖凝膠倒如槽中(主義瓊脂糖凝膠的溫度不要超過(guò)60℃).待凝膠聚合后，輕輕拔掉試樣格.

　　2.在電泳槽兩端活動(dòng)槽中加上緩沖液，把凝膠托盤(pán)兩端的膠條撕掉并移到電泳槽中.

　　3.用與凝膠等同寬度的四層濾紙約20mm長(zhǎng)，并折成直角;濾紙的一端搭在凝膠板上，另一端浸在緩沖液中.

　　4.點(diǎn)樣.

　　5.插上電源線(xiàn)，接同電源開(kāi)始電泳.

　　6.主義不要接錯(cuò)正負(fù)極，檢查無(wú)誤后打開(kāi)電泳儀電源開(kāi)關(guān).根據(jù)凝膠板的薄厚選擇適宜的電壓與電流即可電泳.

　　7.電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，先關(guān)閉電泳儀電源開(kāi)關(guān);隨之打開(kāi)電泳槽取出凝膠托盤(pán).

　　8.觀察和照相：在254nm或300nm紫外燈下觀察，或用135照相機(jī)加橙色濾光片在紫外分析儀上照相.

　　3、 SDS-PAGE膠的干燥

　　膠干燥時(shí)遇到的主要問(wèn)題是凝膠的變形和破裂。將凝膠放在Whatman 3MM濾紙上可防止干燥凝膠變形，但凝膠是否破裂取決于凝膠的厚度和干燥器的質(zhì)量，因此，應(yīng)盡量使用薄膠并使凝膠干燥器處于良好狀態(tài)，使其真空壓力波動(dòng)極少。

　　(1)試劑與配制：

　　固定液：冰醋酸:甲醇:水(10:20:70)

　　(2)電泳后的凝膠用5～10倍體積固定液在室溫下固定，酸性固定液擴(kuò)散后可使凝膠中的溴酚藍(lán)變黃。藍(lán)色全部消失后，繼續(xù)固定5min。為防止凝膠破裂，在進(jìn)行步驟(2)之前可將凝膠浸泡于含20%甲醇、30%甘油的溶液中過(guò)夜。

　　(3)將凝膠標(biāo)記好方向后放在保鮮膜或玻璃紙上面，上面放一張比凝膠四周長(zhǎng)出1～2cm的Whatman 3MM濾紙。

　　(4)另將一張濾紙放在凝膠干燥器上。將Whatman 3MM濾紙/凝膠/保鮮膜或玻璃紙，放在凝膠干燥器上的濾紙上面，保鮮膜或玻璃紙?jiān)谧钌厦妗?

　　(5)放下凝膠干燥器的蓋子，抽真空使凝膠四周封閉以干燥凝膠，干燥時(shí)間常由廠家提供，一般0.75mm厚凝膠干燥2h，如50～65℃可加快干燥進(jìn)程。

　　釋放真空。如加熱狀態(tài)下干燥，則先停止加熱并自然冷卻10min后再釋放真空。